1.
研磨制样:先向研钵中加入少量液氮,等液氮挥发使研钵预冷。再向研钵内?/p>
入适量液氮?/p>
?/p>
-70
度冰箱取出组织,
用镊子从冻存管中夹取一小块放入研钵中?/p>
迅速研磨组织块,成粉末时加?/p>
1ml
?/p>
trizol
,继续研磨,可看到粉末成浆,?/p>
浓变稀,直至组织样全部溶解,用移液枪吸到无?/p>
EP
管?/p>
2. Trizol
法提?/p>
RNA
1)
室温静置
3-10min
,使蛋白质变性;
2)
加入
1/4~1/5
体积的氯仿,颠倒震?/p>
1min
,室温静?/p>
3-5min
,静置分层,?/p>
?/p>
4
℃离心,
12000rpm
?/p>
5min
?/p>
(核蛋白复合体彻底裂解)
3)
吸取上清至无酶的
EP
管中,加入等体积的酚:氯仿,颠倒震?/p>
1min
,室?/p>
静置
3-5min
,静置分层,然后
4
℃离心,
12000rpm
?/p>
5min
,取上清。若是细?/p>
RNA
提取可只加等体积氯仿抽提一次,但对于组织一般都要重复该步骤,至?/p>
有蛋白层为止?/p>
一般抽提两次?/p>
(离心后会分为三次:
上层?/p>
水相?/p>
中间层:
DNA
?/p>
下层?/p>
蛋白?/p>
为了降低水相和有机相分界?/p>
DNA
污染?/p>
不要吸取水相的最下层?/p>
4)
加入等体积的预冷的异丙醇,颠倒混匀,冰上静?/p>
30min
,然?/p>
4
℃离?/p>
12000rpm
?/p>
30min
,弃上清?/p>
(此步骤主要是充分沉淀
RNA
,然后收集。故步骤
中的冰置
30min,
也可以是?/p>
-20°
放置半小时以上,甚至过夜?/p>
5)
加入
100ul 70%
乙醇?/p>
将沉淀吹起来,
注意不要吹散?/p>
然后
4
?/p>
12000rpm
?/p>
5min
?/p>
6)
弃上清,空气中挥发乙醇,至壁上无液滴?/p>
7)
加入适量
DEPC
水,
(一般为
20ul
)溶解?/p>
8)
分光光度计检?/p>
RNA
浓度?/p>
OD
值,?/p>
Total RNA
稀释至
1ug/ul
,备用?/p>