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2016年南方医科大学医学微生物学实验报告
日期 2016年5月22号
题目 实验者 年级专业 指导老师 脓汁和粪便标本中病原菌的检测 成绩 作者:马浩楠 3140020007 参与者名字:马浩楠 丁超 王尧鑫 桂文茁2014级医学影像专业 罗军
一、实验目的
1、掌握培养基制备的原则和一般方法。 2、掌握病原菌的分离与培养方法。
3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法,熟悉细菌基本形态。
4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。 5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。
6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用,掌握纸片扩散法。 7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。
二、实验器材
1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻 度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯
2、脓汁标本1支,粪便标本1支;伊红美兰平板2个,营养琼脂平板2个,伊红美蓝 平板2个,接种环,酒精灯
3、斜面4支、细菌分离培养物(上次实验平板)
4、斜面培养物4支,营养肉汤4支,生理盐水2支,镜油瓶、拭镜纸1套,吸水纸1 本,载玻片4张,染色瓶,染色架
5、斜面培养物4支,营养肉汤培养物(菌液)4支,半固体琼脂4支,营养琼脂平板4 个,糖发酵管1套,抗菌素纸片1套,眼科镊子2把
6、半固体培养物4支,药敏试验培养物4个,微量发酵管培养物1套。
三、方法与步骤
1、培养基的制备: 培养基 称量干粉培 养基(g) 11.4 水量(ml) 煮沸(次) 分装(ml) 备注 3瓶,500ml瓶,平板 14支×3,中试管,斜面 20支×2,小试管,肉汤 14支×3,小试管,高层 营养琼脂 300 营养琼脂 2.7 70 3 5 营养肉汤 1.3 60 1 3 半固体琼脂
1.7 60 3 4 (1)营养琼脂培养基的制备:称量11.4g琼脂,置于三角烧瓶中,加入300ml蒸馏水,分2瓶装,用于倒平板。
(2)营养琼脂培养基的制备(用于制作斜面):称量2.9g琼脂,置于三角烧瓶中,加入75ml蒸馏水,放在电炉上,先后煮沸3次,分15支中试管装,每支试管5ml。
(3)肉汤培养基的制备(用于制作液体培养基):称量1.1g琼脂,置于三角烧瓶中,加入50ml蒸馏水,放在电炉上,煮沸1次,分15支小试管装,每支试管5ml。
(4)半固体琼脂培养基的制备:称量1.7g琼脂,置于三角烧瓶中,加入60ml蒸馏水,放在电炉上,先后煮沸3次,分15支中试管装,每支试管4ml。
2、细菌的分离培养 平板划线分离法
甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色)乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色) 丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色)丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色) 步骤:①接种环烧灼灭菌。②取标本3~6ul。③平板采光,当看到平板表面象镜面有反光的时候,保持这个角度,划线时就能看清划线痕迹,以便控制划线。④接种环与平板呈30~40度角,在平板表面上方,以曲线的形式,作大幅度来回连续划线,边划边退,线段要划得长而密集,每区划线不少于30条。⑤烧掉接种环上多余的标本。⑥转动平板,通过第一区5~7次,使接种环重新沾上少量细菌,同样的方法划第二区。⑦转动平板,接种环通过第二区1次,划第三区。⑧转动平板,接种环通过第三区1次,划第四区。⑨划第五区。 3、细菌的纯培养 斜面接种分工
甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面 乙→普通平板→白色菌落→1支斜面 丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面 丁→ EMB平板→粉红菌落→1支斜面 方法:接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后,伸入斜面底部,自下向上先拉 →条细菌接种线→再伸入底部,自下向上,作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面 →斜面正面上2/3作标记:组号、颜色→收集平板-灭菌桶内(平板底部朝下,盖朝上放置)→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。 4、细菌的形态学检查 涂片→干燥→固定→染色 (1)涂片→干燥→固定
甲→黄色,紫黑。 乙→白色,粉红。 丙→黄色,紫黑。丁→白色,粉红。
方法:涂片:①接种环取盐水3ulX2滴,水滴间距小于2cm;②取菌苔少许(1mm小菌落半个)与盐水混勻,涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立,待环内菌膜破裂,接种环烧灼灭菌。→干燥→固定:手持载玻片→端,涂膜朝上,两个涂膜快速通过火焰外层3次,时间2?3秒钟。 (2)革兰染色
涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ 95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干,