内容发布更新时间 : 2024/6/2 13:37:33星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

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深圳大学考试答题纸

(以论文、报告等形式考核专用)

二○ 一 一 ～二○ 一 二 学年度第 2 学期

苏庆宁

课程编号

课程名称 生物信息学

主讲教师

李凌云 买制刚

学 号

姓名

专业年级

2012级生物医学工程（医）

评分

教师评语： 题目： 小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建

摘要：利用NCBI genebank数据库及genetool软件设计引物，克隆小鼠TNF-α启动子序列，将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中。将经过鉴定的重组载体pGL3-TNFα-promoter转染巨噬细胞264.7，应用萤光素酶检测系统检测其活性。

1.查找启动子序列：

打开NCBI的Map viewer网站，网址.nih.gov/mapview/index.html，输入要查询的TNF-α，得如下结果：

再点击右下方quick filter 勾上gene选项，找到TNF-alpha基因所在染色体上的位置： 点击17号染色体上的Genes seq（注：下边的几个序列也是一样的，一般选第一个即可）出现如下信息：

点击，Download/View Sequence/Evidence，查看基因序列： Sequence Format 选择Genebank 形式，再点击Display,出现：目的基因的相关序列以及信息。 可知转录位点从基因1956位开始转录，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA上序列上分成了几段。promoter位于转录起始位点上游约2000bp区域，启动子序列为： 2.引物设计

用NCBI查出小鼠TNF-α的基因的CDS：

打开网站：/index.php，查询在这段开放阅读框内0 cutter的酶，并结合结合实际情况，使用列表中的XhoⅠ 、HindIII作为引物酶。

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用genetool软件设计引物： Forward Primer Name: TNF-α

deg 1-21 Len:21 Score:76* Predicted Melting Temperature: 58 degrees Celsius GeneTool Score: 76 Start: 1 End: 21 Length: 21 Bases: 5'CCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3' Reverse Primer Name: TNF-α

deg 1934-1956 Len:23 Score:74* Predicted Melting Temperature: 51 degrees Celsius GeneTool Score: 74 Start: 1934 End: 1956 Length: 23 Bases: 5'CCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT 3' 上游引物P1 5'端加入XhoⅠ酶切位点（CTCGAG）即

5'CTCGAGCCCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3' 下游引物P2 5'端加入HindIII酶切位点（AAGCTT）即 5'AAGCTTCCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT3' 请外面引物公司合成，扩增基因片段长度为：233bp。 3.基因组DNA提取

按组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明提取小鼠基因组DNA。-20℃保存备用。 4.目的片段的扩增

以基因组DNA为模板，用上游和下游引物扩增TNF-α启动子DNA序列。用genetool软件模拟电泳结果：

MWM:DNA marker 1:PCR产物，大小为233bp

图1。TNF-α启动子序列PCR产物

5.TNF-α启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定

回收产物的电泳条带，用试剂盒对PCR产物进行纯化。XhoⅠ和HindⅢ分别双酶切扩增的TN-Fα启动子和载体pGL3–basic，琼脂糖凝胶分离酶切产物，AXYGEN胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。T4 DNA连接酶连接pGL3-basic和TNF-α片段过夜，转化感受态细菌JM109，接种含IPTG和X-gal的Amp+LB培养皿培养。取阳性克隆菌酶切、测序。重组体 命名为pGL3-TNFα-promoter。用genetool软件模拟双酶切电泳结果：

MWM:DNA marker 1:重组质粒pGL3-TNFα-promoter

图2.限制性内切酶双酶切图

6.基因测序结果：

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7.转染及荧光素酶活性检测

实验组将pGL3-TNFα-promoter+pRL-SV40（转染效率内参），对照组pGL3-basic+pRL-SV40分别用脂质体Lipofectamine 2 000瞬时转染巨噬细胞264.7。实验组、对照组各24孔。转染36 h后，按照双荧光素酶检测试剂盒（Dual Luciferase Assay System）的操作说明处理转染细胞，并通过GloMax 20/20发光检测仪测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的荧光值， 将两者的比值，作为衡量荧光素酶活性的依据。 Reference:

1.LIU B.Construction and identification of human puma promoter luciferase report gene

vector[J].Medical Journal of National De-fending Forces in Southwest China,2009,19(1):42-44. 2.欧阳华伟，罗成群，曹海梅.小鼠肿瘤坏死因子α启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定.中国现代医学杂志.2010 10（20）：1453-1456

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